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藍(lán)莓組培技術(shù)

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來源：作者：發(fā)布時(shí)間：2013-07-23 17:14

　　一、實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)
　　1.洗滌室：器具的洗滌、干燥
　　2.配置室：進(jìn)行藥品的保存、配置、消毒、分裝等。
　　3.滅菌室：對(duì)培養(yǎng)進(jìn)行高溫高壓滅菌，有時(shí)候也會(huì)把培養(yǎng)基的熬制、分裝放在此房間。
　　4.接種室：進(jìn)行材料的接種，內(nèi)置超凈工作臺(tái)或接種箱。外設(shè)緩沖間-放置拖鞋、工作服、工作帽等。
　　5.培養(yǎng)室：植物材料的無菌培養(yǎng)，室內(nèi)主要有培養(yǎng)架和控制溫度及光照的設(shè)備。
　　其他配套：大型組培室，包括工廠化組培車間還好專門配套倉(cāng)庫(kù)、更衣室和辦公室等，有的還要配備細(xì)胞學(xué)觀察實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行培養(yǎng)材料的組織學(xué)、細(xì)胞學(xué)、觀察照相等。
　　二、常用設(shè)備和器材
　　1.高壓蒸氣滅菌鍋：用于培養(yǎng)基、蒸餾水和接種器械的滅菌消毒。
　　2.超菌工作臺(tái)：用于培養(yǎng)物的無菌操作。（由鼓風(fēng)機(jī)、濾板、操作臺(tái)、紫外燈和照明燈組成）
　　3.接種工具：包括鑷子、剪刀、解剖刀、灑精燈、接種器械滅菌器等。
　　4.培養(yǎng)設(shè)備：包括空調(diào)機(jī)、定時(shí)器、溫度控制器、增濕機(jī)或去濕機(jī)、培養(yǎng)架、光照培養(yǎng)箱等。
　　5.配置設(shè)備：包括天平、酸度計(jì)、磁力攪拌器、蒸餾水器、烘箱或玻璃儀器烘干器、電爐、藥品柜、冰箱或冷柜、晾瓶架等。
　　在這些儀器設(shè)備中，高壓滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、電子天秤、培養(yǎng)架、冰箱、接種工具等是組培必備的，也是每天都要用到的，因此質(zhì)量要可靠。 999苗木網(wǎng),www.jin1234.com
　　三、玻璃器皿的選擇和清洗
　　1.玻璃器皿的選擇
　　*試管-適合于用少量培養(yǎng)基及試驗(yàn)各種不同配方時(shí)選用。
　　*三角錐瓶-適用于各種培養(yǎng)（如固體培養(yǎng)、液體培養(yǎng)、大規(guī)模培養(yǎng)或一般培養(yǎng)）。
　　*L形管和T形管-為專用的旋轉(zhuǎn)式液體培養(yǎng)試管。
　　*培養(yǎng)皿-適于作單細(xì)胞的固體平板培養(yǎng)、胚和花藥培養(yǎng)和無菌發(fā)芽。
　　*角形培養(yǎng)瓶和圓形培養(yǎng)瓶-適用于液體培養(yǎng)用，如單細(xì)胞和原生質(zhì)體的淺層培養(yǎng)。
　　*組培瓶/果醬瓶-常用作試管苗大量繁殖用的培養(yǎng)瓶。
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　　2.玻璃器皿的清洗
　　（1）清洗玻璃器皿用的洗滌劑有肥皂、洗潔精、洗衣粉、和鉻酸鉀洗滌液。
　　（2）清洗時(shí)先將器皿中的殘?jiān)ィ们逅磧簦儆脽岬姆试硭蛳礉嵕磧簦逅疀_洗干凈后用蒸餾水沖洗一次，干后備用。
　　（3）洗凈的玻璃器皿應(yīng)透明發(fā)亮、內(nèi)外壁水膜均勻，不掛水珠。
　　四、影響藍(lán)莓組培的因素
　　1.樹種因素：(1)基因型，(2)植株年齡，(3)組織和器官的年齡，(4)植株的生理狀態(tài)，(5)取材年份及生長(zhǎng)條件，(6)取材部位及大小。
　　2.培養(yǎng)基因素：無機(jī)鹽、有機(jī)化合物、植物激素、天然提取物、瓊脂、PH值、滲透壓、活性炭。藍(lán)莓組織培養(yǎng)的成功與否，除了培養(yǎng)材料本身的因素外，很大程度上取決于對(duì)培養(yǎng)基的選擇。培養(yǎng)基的種類、成份等直接影響培養(yǎng)材料的生長(zhǎng)發(fā)育。故應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)材料的種類和部位，選取適宜的培養(yǎng)基。

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　　3.外植體的選擇和滅菌：不同品種、不同器官之間的分化能力有差別，且組織培養(yǎng)是建立在無菌操作基礎(chǔ)之上的專門技術(shù)，因此在進(jìn)行藍(lán)莓組織培養(yǎng)時(shí)，必須選擇合適的外植體進(jìn)行滅菌操作，以確保組織培養(yǎng)工作的順利進(jìn)行。
　　4.環(huán)境因素：(1)光照：包括光強(qiáng)、光質(zhì)、光周期，(2)溫度，(3)濕度，(4)氣體。
　　五、藍(lán)莓培養(yǎng)基的主要成分
　　（一）、基本培養(yǎng)基的主要成分：
　　1.無機(jī)鹽：(1)大量元素：C.H.O.N.P.K.Ca.Mg.S.Cl。(2)微量元素：Fe.Cu.Mo.Zn.Mn.Co.B.Na。(3)水：培養(yǎng)基95%是水，應(yīng)使用蒸餾水、雙蒸水或使用去離子水,水應(yīng)放在塑料容器中。
　　2.有機(jī)化合物：(1)糖(碳源和能源)，(2)維生素類：有維生素b1(鹽酸硫胺素)、維生素b6(鹽酸砒哆醇)、生物素、煙酸、葉酸等，(3)氨基酸類(有機(jī)氮源)。
　　3.植物激素（生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)）：
　　（1）生長(zhǎng)素：主要包括IAA（吲哚乙酸）、NAA（萘乙酸）、2,4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）、IBA（吲哚丁酸）；它們的主要作用是誘導(dǎo)愈傷組織的形成、胚狀體的產(chǎn)生以及試管苗的生根，更重要的是配合一定比例的細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)腋芽及不定芽的產(chǎn)生；作用的強(qiáng)弱順序?yàn)椋?，4-D>NAA>IBA>IAA。
　　（2）細(xì)胞分裂素：天然：6-BA（6－芐基酰嘌呤）、KT（激動(dòng)素，糠基酰嘌呤）；人工：ZT（玉米素）、2-iP（2-異戊烯酰嘌呤）；它們的主要作用是促進(jìn)細(xì)胞的分裂和器官的分化、延緩組織的衰老、增強(qiáng)蛋白質(zhì)的合成、抑制頂端優(yōu)勢(shì)、促進(jìn)側(cè)芽的生長(zhǎng)及顯著改變其他的激素作用；作用的強(qiáng)弱順序?yàn)椋篢DZ,4PU>ZT>2-iP>6-BA>KT。

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　　（3）赤霉素：GA3。
　　（4）乙烯及乙烯抑制劑。
　　4.天然提取物（如椰乳、酵母提取物、番茄汁、香蕉泥等），其作用是提供一些必要的微量營(yíng)養(yǎng)成分、生理活性物質(zhì)和生長(zhǎng)激素等。
　　5.瓊脂（是從海藻中提取的一種高分子碳水化合物），其主要作用是使培養(yǎng)基在常溫下凝固，同時(shí)不參與代謝。
　　6.活性炭：加入培養(yǎng)基中的目的主要是利用其吸附能力，減少一些有害物質(zhì)的影響，如可以防止酚類物質(zhì)污染而引起組織褐化死亡。
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　　(二)、藍(lán)莓培養(yǎng)基：上面提到這些物質(zhì)是組培過程經(jīng)常用到，具體到藍(lán)莓，一般用WPM培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基，激素多用KT、6-BA，天然提取物和活性炭一般不用。
　　六、藍(lán)莓外植體的選擇和滅菌
　　（一）、外植體的選擇：以春季初發(fā)的嫩梢最為合適，取材時(shí)間要在晴天下午取材，取材部位以靠近木本的下部?jī)?nèi)堂枝為好。
　　(二)、外植體的滅菌方法
　　1、常用滅菌藥劑的使用和效果：
　　消毒劑使用濃度/%清除難易消毒時(shí)間/min滅菌效果
　　次氯酸鈉2易5-30很好
　　次氯酸鈣9-10易5-30很好
　　漂白粉飽和溶液易5-30很好
　　升汞0.1-1較難2-10最好
　　酒精70-75易0.2-2好
　　過氧化氫10-12最易5-15好 999中國(guó)苗木網(wǎng),www.jin1234.com
　　溴水1-2易2-10很好
　　硝酸銀1較難5-30好
　　抗菌素4-50mg/L中30-60較好
　　對(duì)于藍(lán)莓而言，一般先用75%酒精處理10-30苗，再用升汞處理5-10分鐘，根據(jù)材料的老嫩程度、外界環(huán)境不同而選擇適當(dāng)?shù)奶幚頃r(shí)間，一般是從低到高作實(shí)驗(yàn)摸索最佳的處理時(shí)間。
　　2.滅菌方法：
　　(1)莖尖、莖段及葉片等的消毒：用清潔劑清洗、水流沖刷4小時(shí)左右---75%酒精浸泡10-30秒---無菌水洗1-2次---升汞溶液泡5-10min---無菌水洗7-10次
　　七、外植體接種和培養(yǎng)
　　1.外植體的接種
　　（1）接種室的消毒：用70%酒精噴霧使細(xì)菌和真菌孢子隨灰塵的沉降而沉降,再用紫外燈照射20min；并且每月用高錳酸鉀與甲醛蒸氣熏蒸一次。超凈工作臺(tái)可用新吉爾滅或酒精擦洗，其它一切器皿、衣物都要經(jīng)嚴(yán)格的滅菌才能帶進(jìn)接種室。
　　（2）接種：左手拿培養(yǎng)瓶，右手拿接種工具接種，瓶口要靠近酒精燈火焰、接種動(dòng)作要快，以免造成污染。
　　2.培養(yǎng)方法
　　（1）根據(jù)外植體不同可分為：胚胎培養(yǎng)、器官培養(yǎng)、組織培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)。藍(lán)莓常用的是器官培養(yǎng)或組織培養(yǎng)。
　　（2）根據(jù)培養(yǎng)方式不同可分為：固體培養(yǎng)、液體培養(yǎng)、半固體培養(yǎng)、雙層培養(yǎng)。具體到藍(lán)莓，一般都是固體培養(yǎng)，即用瓊脂作為支持物，在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)藍(lán)莓組培苗。

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　　3.培養(yǎng)條件：指溫度、濕度、光照、PH值、氧和其它氣體等。藍(lán)莓一般在25度左右進(jìn)行光照培養(yǎng)，光強(qiáng)一般為3000-5000Lux，培養(yǎng)間濕度不宜過高，要控制是60%以下。經(jīng)過三十多天的培養(yǎng)，就可進(jìn)行分苗了。
　　八、組培苗生根和馴化
　　增值的藍(lán)莓苗達(dá)到所需的規(guī)模后，即可進(jìn)行生根處理了。藍(lán)莓一般采取瓶外生根技術(shù)，即在溫室內(nèi)進(jìn)行扦插生根，此種方法可以大量節(jié)省組培室的投資規(guī)模和生產(chǎn)成本。

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