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植物組織培養的技術原理

來源：未知作者：admin 發布時間：2013-08-01 23:33

　　植物組織培養是指將植物體的一部分接種在合成培養基上，使其按照預定目標生長發育成新植株。近年來，花卉組織培養及快繁脫毒技術越來越多地應用于花卉種苗繁殖生產中。

　　一、組織培養在花卉產業中的應用
1.快速、大量繁殖優良品種組織培養技術已成為種苗生產的主要技術之一。經組織培養，可增加繁殖系數，加快繁殖速度，可生產出種性純、品質好、產花量高的生產性用苗。
在花卉育種過程中，不斷的雜交、選種極大地擴展了花卉的花形與顏色，使得花卉在各方面都越來越接近人們的需求。但在同時，也造成了花卉基因類型的高度異質化———子代不易有均一表現。而組培苗是在母株器官、組織或細胞的基礎上發展起來的，可以保持母株的全部特性（花形、花色、株形、開花習性、抗逆性等），因而可以根據需要來選擇集多種優良性狀于一體的植株加以分生，從而得到大量與母株一模一樣的植株。

　　2.培育脫毒苗木采用組織培養技術，利用植株的分生組織不易感染病毒的原理，可以對花卉植株的分生組織進行組織培養來繁殖苗木，防止親代植株的病害傳遞給子代，從而達到脫毒的目的。
　　病毒病對長期應用營養繁殖（分株、扦插等）的觀賞植物及其生產的危害相當嚴重。由于觀賞植物多采用營養繁殖，如嫁接、分株、壓條等方法繁殖時，病毒（及類病毒）則通過營養體及刀具、土壤傳遞給后代，大大加速了病毒病的傳播與積累，導致病毒病的危害越來越嚴重。據統計，觀賞植物的病毒已多達100多種，并且逐年有新增病毒的報道。觀賞植物因病毒病大大影響其觀賞價值，表現在康乃馨、菊花、百合、風信子等的鱗莖、球莖與宿根類花卉及蘭科植物等嚴重退化，花少且小，花朵畸形、變色，大大影響觀賞價值，嚴重者甚至導致某些品種的滅絕，嚴重制約觀賞植物生產的發展，這也是我國切花品種跨不出國門的原因之一。 999中國苗木網,999miaomu.com

組培快繁技術已應用到蝴蝶蘭的栽培中

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非洲菊也可以通過組培快繁技術進行繁殖 999苗木網,www.jin1234.com

　　植物組織培養脫毒的原理主要是利用莖尖分生組織不帶毒或少帶毒。感病植株體內的病毒分布不均勻，其數量隨植株部位和年齡而異，越靠近莖尖頂端的區域，病毒的濃度也越低。分生區域無維管束，病毒只能通過胞間連絲傳遞，趕不上細胞不斷分裂和活躍的生長速度，因此生長點含有病毒的數量極少，幾乎檢測不出病毒。因此，莖尖培養時，切取莖尖的大小對脫毒效果有很大影響，莖尖越小效果越佳，但太小時不易成活，過大則不能保證完全除去病毒。不同種類的植物和不同種類的病毒在莖尖培養時切取的莖尖大小也不相同。一般來說，切取0.2至0.5毫米帶1至2個葉原基的莖尖進行培養即可。

　　3.保存種質資源常規有性繁殖往往會造成大小不一的變異，如紅色可能變異成粉紅色等。組織培養不存在變異，可保持原母本的一切遺傳特性，防止種質資源的退化。很多無性繁殖的植物因沒有種子，無法長期保存，其種質資源傳統上只能在田間種植保存，耗費人力物力，且資源易受人為因素和環境因素影響而丟失。而用組培方法保存，可大大節省人力、物力，并延長保存期，保證種質資源不會突變和流失。

　　4.花卉育種在花卉育種上，主要在胚胎培養、單倍體育種、體細胞雜交和植物基因工程等方面應用較多，此外還可采用愈傷組織誘變、花粉培養等多種方法來進行花卉育種。通過組織培養，可縮短育種年限和世代，也有利于基因突變中隱性突變的分離。利用組織培養技術可以對花粉和花藥進行培養，得到單倍體植株，從而縮短了育種周期，尤其是對木本的花卉育種特別有意義。 999中國苗木網,999miaomu.com
　　（1）無性系變異的利用植物細胞或原生質體經愈傷組織誘導再生植株的過程中，可能伴隨著廣泛的變異，這種變異稱為體細胞無性系變異。植物體細胞無性系變異是遺傳變異的重要來源之一，它具有變異廣泛、后代較穩定、基本保持原品種特性等優點。
　　（2）遠緣雜交種后代的獲得百合、鳶尾等許多花卉雖然可以進行遠緣雜交，但是由于生理代謝等方面的原因，常使雜種胚早期敗育，因而得不到雜種植物。而在試管中進行胚培養，可使其順利生長，得到遠緣雜種。
　　（3）草花育種組織培養是應用較早，比較成熟的一項技術，在草花育種中主要用作其他育種手段的輔助技術。例如，當某一變異植株上具有優良性狀而尚未確定該性狀能否遺傳時，可用莖尖組培技術擴繁，增加供試材料，防止有益變異的組織丟失。另外，誘導胚狀體過程中常產生變異，因而組培也是一種引發變異的育種手段。同時，細胞在離體培養過程中會產生廣泛的無性系變異，通過協迫培養，可以獲得具有相應耐性的愈傷組織，誘導產生再生體植株，從而獲得耐性遺傳。
　　（4）花卉品種的提純復壯運用組織培養，苗木的復壯過程很明顯，對于長期運用無性方法繁殖并開始退化的花卉品種，如康乃馨采用組培方法繁殖，可使個體發育向年輕階段轉化。中國苗木網,www.jin1234.com

　　二、花卉組織培養的途徑
1.生長點途徑通過誘導莖尖或側芽，形成大量腋芽，從而獲得大量幼小植株。此途徑產生變異的機會較小，所獲瓶苗的品質也較均勻。多數花卉植物的組培苗都采用這一途徑進行快速繁殖。
　　2.胚狀體途徑通過誘導植物體細胞或組織產生胚狀體，再由胚狀體發育成大量植株。此途徑較易產生變異。一品紅、蘇鐵等通常采用此途徑進行繁育。
　　3.愈傷組織途徑外植體經植物生長調節劑處理后先形成愈傷組織，再經器官分化形成許多芽體，達到大量繁殖的目的。此途徑產生變異的機會比其他兩種途徑都大。

　　三、組織培養對實驗室的要求花卉組織培養是在人工控制的條件下培養花卉，是一種花卉現代工廠化生產新技術，所以其對實驗室及設備有一定的要求。
　　1.實驗室方面（1）化學實驗室：主要承擔配制培養基的任務。要求具有各種化學藥品試劑、各種玻璃器皿、稱量天平等。
　　（2）準備室：主要進行玻璃器皿的洗滌，要求有上下水裝置。進行培養基礎用具的消毒。要有高壓滅菌鍋，具有水源和電源。
　　（3）接種室：是花卉材料分離、消毒接種和轉移的場所。要求密閉、清潔、整齊，裝有紫外燈，能隨時滅菌。
　　（4）培養室：是花卉材料培養生長的地方。要求清潔、保溫好、室溫均勻一致，并有絕熱、防火性能。 999中國苗木網,999miaomu.com
　　為了保證接種室和培養室清潔無菌以及減少由于環境污染進而導致培養基污染而造成的浪費，建議最好安裝十萬級的凈化設備，用物理滅菌手段代替化學滅菌，達到減少環境污染，實現可持續發展。

　　2.設備方面（1）天平：供配制培養基時稱量藥品和激素用。大量元素用普通天平；微量元素和激素用分析天平。
　　（2）酸度計：測定培養基的pH值。
　　（3）高壓滅菌鍋：用來供培養基和器械用具滅菌。
　　（4）烘箱：用于洗凈的玻璃器皿干燥滅菌。
　　（5）蒸餾水制造裝置：用來得到純凈水，供培養用。
　　（6）冰箱：供貯放母液和植物材料用。
　　（7）接種箱或超凈工作臺：為植物材料接種或轉移的操作場所。
　　（8）空調機：控制室溫用。四、花卉組織培養對培養基的要求培養基是花卉植物組織培養中十分重要的基質，目前應用的有很多種，但其主要成分大體相同。除主要成分是水外，其他還有大量元素、微量元素、維生素、生長調節物質、蔗糖和瓊脂等。

　　目前花卉組織培養中應用最多的為MS培養基。其組成是在配制1升培養基時，加硝酸銨1.65克、硝酸鉀1.9克、氯化鈣0.44克、硫酸鎂0.37克、磷酸二氫鉀0.17克、碘化鉀0.83毫克、硼酸5.2毫克、硫酸鎂22.3毫克、硫酸鋅3.6毫克、鉑酸鈉0.25毫克、硫酸銅0.025毫克、氯化鈷0.025毫克、硫酸鐵27.8毫克、蔗糖20至40克和瓊脂4至10克。其他生長調節物質要根據花卉的種類和培養目的而確定。 999苗木網,www.jin1234.com

　　配制培養基前要準備好燒杯、量筒、吸管、容量瓶等玻璃儀器，預先稱好藥品用蒸餾水溶解，分別配制成10倍或100倍母液備用。配制培養基時準備好培養瓶，可以是三角瓶也可以用目前市場上推出的塑料瓶、大燒杯、分液器等儀器，配制時先將瓊脂溶化，再加入各種母液和蔗糖，然后用1摩爾的氫氧化鈉或鹽酸調整培養基的pH值，一般掌握在5.8左右。以后可分注到培養瓶中，蓋好瓶蓋。培養基配好要經高壓滅菌，冷卻后放到培養室預培養3天，如沒有雜菌污染，才可進行花卉材料的接種。

　　五、組培法繁殖花卉的基本階段
1.外植體材料的選取從理論上講，越是具有全能性的部位其組培的成功性就越高。植物具有全能性的細胞通常有三類：一是受精卵；二是發育中的分生組織細胞，即分生組織、根尖、嫩莖、幼葉、花等；三是雌雄配子及單倍體細胞。
　　對大多數種子植物來說，莖尖是最好的部位，但往往受到材料來源的限制，為此莖段也得到了徹底的應用，而葉片的培養利用更為普遍，材料來源也較豐富。子葉和下胚軸的培養對于難培養的植物很有效，花粉和花藥培養則成為育種和脫毒苗獲取的重要途徑之一。
　　選材時應注意選取帶菌少、生長時間短、生長旺盛的材料，還應注意取材的時期。大多數植物應在生長開始的季節進行采樣，生長末期或休眠期的外植體對誘導反應遲飩。器官的狀態也有影響，沿花卉的主軸，越往上的部位經組培形成的器官其生長的時間越短且越易形成花器官；而下部組織產生營養組織的比例較高。 999苗木網,www.jin1234.com

　　2.材料的滅菌處理花卉植物組織培養即無菌培養，也就是要求培養的材料不帶有雜菌。從田間或溫室等地切取花卉材料時，應選擇健壯無病蟲母株，取幼嫩、分生能力強的部位，以利生長。
　　取來的材料雖經選擇，外部總還有不少雜菌。為此，接種前應進行表面滅菌。通常先用自來水沖洗十幾分鐘，把泥刷去。沖洗干凈后，用70％的酒精浸泡10至15秒鐘消毒。接著用無菌水（經高壓滅菌的蒸餾水）沖洗兩次，再用10％的漂白粉澄清液浸泡20分鐘消毒或用0.1％的氯化汞浸泡3至15分鐘，最后用無菌水沖洗3至4次。帶有茸毛不易濕潤消毒的材料可加些洗衣粉。上述操作皆應在接種箱或超凈工作臺等無菌環境條件進行。經過表面滅菌的材料，用無菌濾紙將水吸掉，再用解剖刀切取所需部位，通常幾毫米大小即可。培育無病毒苗則應在1毫米以下，然后用解剖針或槍式鑷子將材料接種到培養瓶內。工具用完即應在95％酒精中蘸一下，用干熱滅菌器或用火焰消毒法消毒，避免工具帶菌造成交叉污染。操作時應穿工作服、戴工作帽，事先洗凈手，然后再用酒精棉擦拭一遍。

　　3.無菌培養體系的建立選擇健壯無病蟲害的花卉植物母株，種植于室內或溫室中經過蒸汽消毒的培養基上，2至4周后，再從母株上采取剛生長不久的莖頂或芽體（這些部位分生能力強且不易受污染）。莖頂或芽體以清水洗滌干凈后，先用70％（體積數，下同）的酒精表面消毒15至30秒，再用1.0克/升的升汞（HgCl　2）溶液（以浸沒莖頂或芽體為準）消毒10分鐘左右，然后，再用無菌水沖洗5至7次。在超凈臺內，先用無菌濾紙吸干莖頂或芽體表面的水分，然后摘取適當大小的莖尖或芽體于誘芽培養基中培養。 999中國苗木網,www.jin1234.com
　　誘芽培養基可采用基本培養基
　　MS，生根培養基可用1/2MS。激素可控制在6－BA（6－卞基腺嘌呤）1至5毫克/升，NAA（萘乙酸）0.1至0.5毫克/升范圍內。誘芽、生根培養基附加的蔗糖量分別為30克/升和15克/升左右，瓊脂7至8克/升，pH值為5.7至5.8。培養溫度為23℃至27℃。光照時間每天為10至14小時，光照強度為1000至2000勒克斯。

　　4.叢生芽的分化及增殖篩選合適的培養基進行芽分化及增殖培養，而后繼代培養，以使外植體在短期內產生大量不定芽。
　　花卉材料接種后放到培養室培養。培養室是花卉材料培養生長的場所，一般幾至十幾平方米皆可。高度約2米左右，空間小，可節省控溫能源。把培養材料放在培養架上培養。培養架可由木材或金屬制成，4至5層，每層高40至50厘米，常規方法是將日光燈裝在上方。架長1.2米左右，與40瓦日光燈長度一致，寬80至90厘米。每一層可裝2盞日光燈，這樣培養時的照度約為3000勒克斯。
　　目前市場上有一種加入稀土的植物培養補光燈，一盞燈的亮度和強度相當于兩盞日光燈。經過實驗，這種燈下培養的植物葉片或莖中的色素形成充分，對植物生長有利，值得推廣。另外，可以節約一倍多的能源，不但降低散熱，也可減少空調的工作強度，從而大大降低培養成本。 999苗木網,999miaomu.com
　　培養室大多采取晝夜恒溫培養，其溫度為25℃±2℃，也有采取晝夜變溫培養的，夜晚溫度可低些，這應根據花卉生長需要而定。每天燈光照明12至16小時。

　　5.壯苗生根增殖繁殖所得到的不定芽，要轉移到不含任何激素，或者不含任何細胞分裂素而只含有一定量生長素的生根培養基中，經誘導生根培養，才能得到完整的組培苗。

　　6.試管苗煉苗處理及移植（假植）生根苗的移栽是組織培養育苗的重要一環，只有移栽成活才能達到快速育苗的目的。
　　花卉試管苗由人工提供各方面優越條件，一般生長發育好，根系也多。可是往往由于沒掌握其特性，而造成移栽時成活率不高。
　　這是因為，花卉材料在瓶中處于異養生活狀態，可以說比溫室生長的花卉還要嬌嫩得多。而突然從瓶中移到土壤讓其過自養生活，往往由于變化太劇烈而造成損傷甚至死亡。為此，將已生根的瓶苗移出進行煉苗，應注意調控光線與溫度。經常調整瓶子位置，使其各個方向均勻受光。2至3天后，可適當旋松瓶蓋，使空氣慢慢進入，使瓶苗逐步適應自然環境，增強抗逆力。
　　將長到一定大小（5至6片真葉或苗高4至5厘米）、生有4至5條根的組培苗經開瓶煉苗后，洗掉苗上的培養基，將其移栽到保水、透氣性好的基質或苗床土中。理想的基質是蛭石，一般為河沙、蛭石、園土等按一定比例混合而成。移栽后的組培苗前期宜生長在適溫、適濕的環境中，逐漸使其適應外界環境。 999苗木網,www.jin1234.com
　　煉苗7至10天后進行移植。移植（假植）前，將瓶苗根部的培養基洗凈，依大小進行分級。將已分級的瓶苗以溝植或穴植方式植入栽培基質中。移植初期的一周內，應采用塑料薄膜覆蓋和用噴霧器澆定根水等措施，以保持濕度，并遮去50％至60％的陽光。試管苗經2至3周馴化后，即可移至培養土中。
　　組培苗由于組織幼嫩，在移植時易滋生雜菌，造成苗霉爛或根莖處腐爛，從而導致死亡。因此可在整個生長期，每間隔7至10天輪換噴一次殺菌劑，如多菌靈、百菌清、甲基托布津等進行預防，而且可以用0.1％多菌靈洗根，并在種植后用它來澆透水，以清除雜菌對首次移栽幼苗的危害。
　　（本版圖片由王麗勉提供）